Aktivita 1.4

Číslo a názov aktivity1.4 Aplikovaný výskum v experimentálnych biotechnológiách
Názov špecifického cieľa1. Vybudovanie pracoviska komplexného výskumného, inovačného a kompetenčného regionálneho centra na SPU v Nitre
Cieľ aktivity

Ciele aktivity 1.4 Aplikovaný výskum v experimentálnych biotechnológiách sú:
A.    Vytvorenie  materiálno-technickej bázy v oblasti experimentálnych biotechnológií
B.    Aplikovaný výskum v oblasti experimentálnych biotechnológií

Opis aktivity

A. Vytvorenie materiálno-technickej bázy v oblasti experimentálnych biotechnológií
Funkcia:
Aplikovaný výskum v oblasti experimentálnej biotechnológie bude orientovaný do troch oblastí (živočíšne biotechnológie, rastlinné biotechnológie a mikrobiálne biotechnológie), ktoré budú koncentrovať kritickú masu výskumného potenciálu SPU, ako aj potrebnú technickú infraštruktúru a ktoré budú disponovať potrebnými kompetenciami koordinácie a riadenia, jednotlivých prioritných oblastí vedeckovýskumnej činnosti v rámci SR.
Hlavným cieľom aktivity (1.4) je vybudovanie jednotlivých špecializovaných laboratórií ako: Laboratória živočíšnych biotechnológií (1), Laboratória rastlinných biotechnológií (2), Laboratória experimentálnej biológie (3) a Laboratória experimentálnej mikrobiológie (4)). V rámci tejto aktivity budú vytvorené aj integrálne laboratóriá pre základné kvantitatívne, spektroskopické, genetické a mikroskopické analýzy. Ako súčasť tejto aktivity budú vybudované pomocné laboratórne priestory čiastočne zabezpečujúce požiadavky správnej laboratórnej praxe.
Výstupy:
Výstupom bude vybudovanie laboratórií:
1.    laboratórium živočíšnych biotechnológií,
2.    laboratórium rastlinných biotechnológií,
3.    laboratórium experimentálnej biológie,
4.    laboratórium experimentálnej mikrobiológie

Vybudovanie integrálnych laboratórií:
5.    spektroskopických analýzy,
6.    genetických analýz,
7.    mikroskopických analýzy
Vybudovanie spoločných miestností v rámci pomocných (servisných) laboratórnych priestorov:
-    príprava vody (destilácia a úprava vody)
-    umyváreň lab. skla, sterilizátorovňa, balenie skla, dekontaminačná miestnosť, miestnosť pre separáciu vzoriek, miestnosť pre tekutý dusík, miestnosť pre chladiace zariadenia, kultivačná miestnosť, lyofilizačná miestnosť a sklady pre chemikálie a laboratórne pomôcky.

B. Aplikovaný výskum
V rámci budovania jednotlivých laboratórií dôjde k vytvoreniu priestorov a vybavenie špičkovými analytickými prístrojmi, ktoré budú doplnené požadovanou základnou laboratórnou aparatúrou.
Hlavné ciele aplikovaného výskumu jednotlivých laboratórií sú nasledovné:
1.    Výskum a aplikácia poznatkov v oblasti živočíšnych biotechnológií, orientovaného do embryotechnológií a detekcii expresie existujúcich a nových génov, ktoré sú objektom genomického výskumu.
2.    Výskum a aplikácia molekulárnych analýzy rastlín s dôrazom na identifikáciu, diferenciáciu, charakteristiku a funkčnú diverzitu obilnín, pseudoobilnín a strukovín.
3.    Výskum a aplikáciu poznatkov molekulových a bunkových mechanizmov účinku biologicky aktívnych látok a toxikantov na živočíšne systémy.
4.    Výskum a vývoj nových biotechnologických postupov a genetických markerov s potenciálnym ďalším využitím v identifikácii mikroorganizmov, vláknitých mikroskopických húb a predovšetkým kvantifikácia ich metabolitov v rôznych prostrediach (pôda, potraviny, živočíšne organizmy).

V nadväznosti na cieľ č. 1
Funkcia – účel:
Otestovať možnosti využitia a uplatnenia najnovších techník kryouchovávania a hodnotenia kvality biologicky cenného materiálu z viacerých zdrojov (spermie, embryá, kmeňové bunky) využiteľných v poľnohospodárskej praxi. Vytvorenie vhodného prostredia pre optimalizácie metodík so zreteľom na správnu laboratórnu prax a aplikáciu v praxi. Aktivita je previazaná s ostatnými aktivitami, v ktorých sa realizuje tá časť výskumu, v ktorej je nevyhnutné využitie molekulárno genetických prístupov.
Metódy:
•    Na základe aktuálnej odbornej literatúry a skúseností s domáceho pracoviska vyhodnotiť a otestovať podmienky techník kryouchovávania a hodnotenia kvality biologického materiálu. Zameriame sa na elimináciu toxických a na aplikáciu netoxických kryoprotektívnych látok. V prípade hodnotenia kvality, cieľom bude využiť najnovšie fluorescenčné markery a TEM za účelom detekcie kvality biologického materiálu po rozmrazení (devitrifikácii).
•    V priebehu realizácie budú používané postupy sekvenovania novej generácie za účelom aplikácie do bezpečnosti potravín, hodnotenia biodiverzity nižších a vyšších organizmov a aplikácie v rôznych oblastiach biotechnológií. Novo získané poznatky budú aplikované v praxi a vytvoria potenciál pre využiteľnosť a transfer poznatkov.

Následnosť krokov:
- Optimalizácia a štandardizácia metodík krykonzervácie a genomických analýz, Vytvorenie vhodného prostredia pre optimalizácie metodík so zreteľom na správnu laboratórnu prax a aplikáciu v praxi. Príprava experimentálneho plánu a konkrétnych protokolov na celé obdobie riešenia.
 -  Overenie účinku netoxických kryoprotektívnych látok pre uchovávanie spermií domácich zvierat. V prípade hodnotenia kvality, cieľom bude využiť najnovšie fluorescenčné markery za účelom detekcie kvality po devitrifikácii. Rozpracovanie a využívanie metód genomických asociačných štúdií s cieľom dopĺňať poznatky o fenotypových dopadoch vybraných skupín génov na metabolizmus vybraných druhov zvierat.
 - Využitie netoxických kryoprotektívnych látok pre uchovávanie embryí a kmeňových buniek domácich zvierat. V prípade hodnotenia kvality, cieľom bude využiť TEM za účelom detekcie kvality biologického materiálu po rozmrazení. Využitie metód genomických a nutrigenomických štúdií s cieľom dopĺňať poznatky o genotypových a  fenotypových dopadoch vybraných skupín génov na metabolizmus vybraných druhov zvierat a ľudí.
 - Záverečné vyhodnotenie výsledkov aktivity, proces štatistické analýzy výsledkov, príprava publikácií, prezentácia výsledkov na pracovisku, sympóziách a konferenciách. Inštalácia prístrojového vybavenia bude realizovaná s dôrazom na ISO 17025.
Vstupy:
•    odborný personál vstupuje do realizácie projektu svojimi vedomosťami a spoluúčasťou na projektoch základného a aplikovaného výskumu, ktoré zabezpečia kontinuálnosť a nevyhnutné zdroje pre priebeh optimalizačných a aplikačných procesov,
•    odborní pracovníci zaradení v personálnej matici zabezpečia inštaláciu a optimalizáciu metodických postupov pre podmienky vytvoreného laboratória. Zabezpečia podmienky správnej laboratórnej praxe a dôrazom na manažérstvo kvality práce v laboratóriu,
•    technické vybavenie Laboratória živočíšnych biotechnológií

Výstup a previazanosť na iné aktivity:
•    výstupom aktivity bude optimalizácia podmienok kryouchovávania biologicky cenného materiálu ako spermie, oocyty, embryá a kmeňové bunky za účelom budovania génovej banky živočíšnych genetických zdrojov s následným využitím v poľnohospodárskej praxi,
•    aktivita je previazaná s ostatnými aktivitami, v ktorých realizuje tú časť výskumu, v ktorej je nevyhnutné využitie molekulárno genetických prístupov,
•    rizikom aktivity je dostatok finančných prostriedkov na realizáciu optimalizačných procesov a aplikačný výskum. Riziká budú eliminované zvýšenou aktivitou v procese získavania národných projektov.

V nadväznosti na cieľ č. 2
Funkcia – účel:
Aktivita zameraná na identifikáciu, diferenciáciu, charakteristiku a funkčnú diverzitu obilnín, pseudoobilnín a strukovín na základe polymorfizmu bielkovín, DNA analýz využívajúcich rôzne techniky ako sú mikrosatelity, retrotranspozómy, QTL techniky, zameraním na vyhľadávanie génov zodpovedných za hospodársky významné  kvalitatívne a kvantitatívne znaky a vlastnosti rastlín.
Metódy:
•    štúdium a rešerš metodík z článkov a monografií dostupných vo svetových knižničných databázach a knižniciach v SR,
•    selekcia a uchovávanie vybraných biologických matríc využitých v ďalších analýzach, nákup chemikálii a analytík,
•    realizácie konkrétnych metodík na vzorkách pseudoobilnín a strukovín, štatistické vyhodnotenie analýz,
•    zamerané na genetické mapovanie a funkčnú diverzitu rastlín (obilnín, pseudoobilnín, strukovín) na základe polymorfizmu bielkovín, zahŕňajú izoláciu zásobných bielkovín, ich elektroforetické delenie a vyhodnotenie,
•    priebežného vyhodnocovania a uchovávania dielčich výsledkov,
•    analýzy genetickej diverzity a vytvorenie binárnej matice, použitej na štatistické analýzy a vytvorenie dendrogramu, ktorý naznačuje genetické vzťahy medzi genotypmi, čo je využiteľné hlavne pre šľachtiteľov.

Následnosť krokov:
 - Štandardizácia metodických postupov molekulových analýz DNA, bielkovín. Vytvorenie vhodného prostredia pre optimalizácie metodík so zreteľom na správnu laboratórnu prax. Príprava experimentálneho plánu a konkrétnych protokolov na celé obdobie riešenia. Štúdium vedeckej literatúry, zameranú na vyhľadávanie génov zodpovedných za rôzne kvalitatívne a kvantitatívne znaky, ako je rezistencia voči patogénom, zlepšenie technologickej a nutričnej kvality zrna.
 - Výber vhodných metodických postupov, ich evalvácia, optimalizovanie a nákup chemikálií a ďalšieho laboratórneho vybavenie potrebného pre samotné analýzy.
 - Realizácia optimalizovaných metodík pri molekulárnych analýzach obilnín, pseudoobilnín a strukovín zameraných na vyhľadávanie génov zodpovedných za kvalitatívne a kvantitatívne znaky, (rezistencia voči patogénom, zlepšenie technologickej a nutričnej kvality zrna).
 -  Záverečné vyhodnotenie výsledkov aktivity, štatistické spracovanie výsledkov, príprava publikácií, prezentácia výsledkov na pracovisku, sympóziách a konferenciách.
Vstupy:
•    odborný personál vstupuje do realizácie projektu svojimi vedomosťami a spoluúčasťou na projektoch základného výskumu,
•    odborní pracovníci zaradení v personálnej matici zabezpečia inštaláciu a optimalizáciu metodických postupov pre podmienky vytvoreného laboratória.
•    technické vybavenie Laboratória rastlinných biotechnológií

Výstupy:
•    odskúšané metodiky, ktoré budú otestované a optimalizované na podmienky daného laboratória a ktoré budú v ďalšom období použité na analýzy vzoriek konkrétneho biologického materiálu,
•    výsledky využiteľné pri selekcii pestovania jednotlivých odrôd obilnín, pseudoobilnín a strukovín v závislosti na ochranu a odolnosť voči ochoreniam rastlín,
•    prezentácia výsledkov formou publikácií v nekarentovaných a karentovaných vedeckých časopisoch, na vedeckých sympóziách, konferenciách.

V nadväznosti na cieľ č. 3
Funkcia – účel:
Účelom aktivity bude skúmať účinok expozície prírodných látok (kvercetin, epikatechín, resveratrol, amygdalín) na prejavy funkčnosti a viability živočíšnych buniek. Stanovenie pôsobenia toxikantov (ťažké kovy, mykotoxíny, alkylfenoly) na živočíšne systémy in vitro a in vivo. Jednotlivé etapy aktivity budú zamerané na sledovanie markerov oxidatívneho poškodenia buniek, antioxidačnej kapacity buniek, biochemických parametrov krvi, hematologických parametrov krvi, hormonálneho profilu. Sledované látky budú v in vitro podmienkach podrobené k stanoveniu molekulových markerov bunkového cyklu, proliferácie, apoptózy resp. nekrózy, mitochondriálnej aktivity, integrity nukleárnej DNA, bunkových membrán a parametrov motility.

Metódy:
-    in vitro kultivácie a manipulácie s bunkami a bunkovými líniami, experimentálne pokusy na laboratórnych zvieratách, mikroskopické, fluorescenčné, ELISA techniky, spektroskopické analýzy, CASA metóda, Western bloting, ELFO, cytometrické analýzy.
Následnosť krokov:
 - Etablovanie a evaluácia prístrojovej techniky. Optimalizácia a štandardizácia metodík, príprava experimentálneho plánu a konkrétnych protokolov na celé obdobie riešenia.
 -  Izolácia, in vitro kultivácia buniek vaječníkov s testovanými látkami. Analýza vzoriek metódami ELISA, imunocytochémia a Western-bloting, In vivo experimenty podávania rastlinných extraktov a ich vplyv na biochemické a hematologické parametre.
 -  Izolácia, in vitro kultivácia buniek prostaty, spermií, adrenokarcinómových buniek s testovanými látkami.
In vivo experimenty podávania rastlinných extraktov a ich vplyv na biochemické a hematologické parametre.
Analýza hormónov ELISA metódu, motility a membránovej integrity CASA, molekulových markerov bunkového cyklu  Western-immunoblotting, apoptóza IFA, mitochondriálna aktivita.
 -  Záverečné vyhodnotenie výsledkov aktivity, štatistické spracovanie výsledkov experimentov, príprava publikácií, prezentácia výsledkov na pracovisku, sympóziách a konferenciách.
Vstupy:
•    odborný personál vstupuje do realizácie projektu svojimi vedomosťami a spoluúčasťou na projektoch základného a aplikovaného výskumu, ktoré zabezpečia kontinuálnosť a nevyhnutné zdroje pre priebeh optimalizačných a aplikačných procesov
•    odborní pracovníci zaradení v personálnej matici zabezpečia inštaláciu a optimalizáciu metodických postupov pre podmienky vytvoreného laboratória. Zabezpečia podmienky správnej laboratórnej praxe a dôrazom na manažérstvo kvality práce v laboratóriu;
•    technické vybavenie Laboratória experimentálnej biológie

Výstupy:
•    experimentálne in vitro štúdie prispejú k poznaniu vzájomných interakcií a možnosti aplikovať tieto výsledky v podmienkach in vivo,
•    stanovené ciele aktivity vychádzajú z najnovších pozorovaní a záverov vedeckých experimentov. Sledované látky sa prirodzene vyskytujú v prostredí a ovplyvňujú resp. môžu byť zavedené aj do oblastí výskumu zdravia ľudskej populácie a zvierat,
•    v súčasnej dobe je málo vedeckých experimentov zaoberajúcich sa danými látkami a závery nie sú komplexne a jasne formulované,
•    výskum v tejto oblasti by priniesol nové dôležité poznatky o ich účinku v živočíšnom organizme, možnostiach ovplyvnenia jednotlivých funkcií zvierat a reálne by poukázal na možnosti terapie týmito látkami bez použitia chemických syntetických liečiv,
•    presné vymedzenie účinkov toxických látok (mykotoxínov, ťažkých kovov, alkylfenolov), v in vitro podmienkach významne prispejú k poznaniu prejavov a realizácie klinických štúdií zameraných na elimináciu účinku týchto látok z hľadiska ochrany zdravia ľudí aj zvierat, a tým zvyšovania produkcie a welfare zvierat,
•    publikácie výsledkov v nekarentovaných a karentovaných vedeckých časopisoch, na vedeckých sympóziách, konferenciách, vydanie vedeckej monografie.

V nadväznosti na cieľ č. 4
Funkcia – účel:
Genotypová a fenotypová charakteristika nových kmeňov mikroorganizmov izolovaných so substrátov  v poľnohospodárstve a potravinárstve (pôda, komposty, biokaly, poľ. odpady, potravinárske komodity, orgány, živočíchov) schopných produkovať nové biologicky aktívne látky (antiobiotiká, rastové látky, toxíny, enzýmy atď.) s možnosťou ich využitia pri výrobe antibiotík, v bioremediačných technikách, v ochrane rastlín a zvierat.
Metódy:
-    zber vzoriek (pôda zaťažená hnojením, pesticídmi, ťažkými kovmi, kadáver hmyzu v pôde, komposty, biokal, potravimové komodity, včelie produkty, orgány zažívacieho aparátu zvierat),
-    izolácia kmeňov mikroorganizmov (baktérií, mikroskopických vláknitých húb) klasickými technikami a novými molekulárnymi metódami,
-    fenotypová a genotypová charakteristika izolovaných kmeňov (BIOLOG, PCR DGGE, sekvenovanie),
-     sledovanie antifungálnej aktivity – diskové a molekulárne metódy, izolácia mykotoxínov (HPLC),
-    sledovanie biodegradačných a synergických účinkov vybraných izolátov cez enzymatické a respiračné charakteristiky,
-    sledovanie virulencie vybraných izolátov proti vybraným škodcom poľnohospodárskych plodín,
-    sledovanie antimikrobiálnej aktivita včelích produktov a ich synergické účinky s antibiotikami

Následnosť krokov:
 -  Optimalizácia a štandardizácia postupov mikrobiologických analýz, štúdium literatúry, príprava experimentálneho plánu  na celé obdobie riešenia.
 -  Fenotypová charakteristika nových kmeňov mikroorganizmov izolovaných so substrátov v poľnohospodárstve, izolácia, identifikácia vláknitých mikroskopických húb z domácich komodít. Nahromadenie vzoriek, izolácia a čistenie kultúr.
 -  Genotypová identifikácia nových kmeňov mikroorganizmov izolovaných so substrátov v poľnohospodárstve a potravinárstve (pôda, komposty, biokaly, poľnohospodárske odpady, potraviny) schopných produkovať nové biologicky aktívne látky, mykotoxíny (antiobiotiká, rastové látky, toxíny, enzýmy atď.) s možnosťou ich využitia pri výrobe antibiotík, v bioremediačných technikách a ochrane rastlín. Testovanie izolátov potenciálne toxinogénnych druhov vláknitých mikromycét na schopnosť produkovať mykotoxíny v podmienkach in vitro detekcia mykotoxínov v komoditách domáceho pôvodu. Izolácia účinných látok s využitím organických rozpúšťadiel, odparovanie vo vákuu a identifikácia látok s využitím HPLC Získanie biologicky účinných látok a ich testovanie na črevný ekosystém hydiny
Využitie klasických mikrobiologických, biochemických, biofyzikálnych metód a metód molekulárnej biológie.
 -  Finálne spracovanie výsledkov a hodnotenie aktivity, štatistická analýza výsledkov, príprava publikácií, prezentácia výsledkov na pracovisku, a konferenciách

Vstupy:
•    odborný personál vstupuje do realizácie projektu svojimi vedomosťami a spoluúčasťou na projektoch základného a aplikovaného výskumu, ktoré zabezpečia kontinuálnosť a nevyhnutné zdroje pre priebeh optimalizačných a aplikačných procesov
•    odborní pracovníci zaradení v personálnej matici zabezpečia inštaláciu a optimalizáciu metodických postupov pre podmienky vytvoreného laboratória. Zabezpečia podmienky správnej laboratórnej praxe a dôrazom na manažérstvo kvality práce v laboratóriu;
•    technické vybavenie Laboratória experimentálnej mikrobiológie

Výstup:
-    vytvorenie  zbierky mikroorganizmov s fenotypovou a genotypovou charakteristikou izolovaných kmeňov mikroorganizmov,
-    pôvodné vedecké práce súvisiace s riešenou problematikou.

Zodpovedná osoba

doc. Ing. Norbert Lukáč, PhD.

Odborní pracovníci

1.    Mgr. Želmíra Balážová, PhD.
2.    doc. Ing. Marcela Capcarová, PhD.
3.    prof. RNDr. Zdenka Gálová, CSc.
4.    prof. Ing. Peter Chrenek, DrSc.
5.    doc. Ing. Soňa Javoreková, PhD.
6.    doc. Ing. Miroslava Kačániová, PhD.
7.    doc. Ing. Adriana Kolesárová, PhD.
8.    doc. Ing. Norbert Lukáč, PhD.
9.    prof. MVDr. Peter Massanyi, DrSc.
10.    doc. Ing. Dana Tančinová, PhD.
11.    doc. Ing. Ján Rafay, CSc.
12.    Ing. Radoslav Židek, PhD.
13.    odborný pracovní 1.4/13
14.    zahraničný expert doc. Dr. Robert Stawarz, PhD.
15.    zahraničný expert doc. Dr. Grzegorz Formicki, PhD.
16.    zahraničný expert Pharm. Dr. Zsolt Forgács, PhD.

Odborní pracovníci boli vyberaní na základe ich odbornosti prezentovanej predovšetkým publikačnou činnosťou, skúseností s realizáciou výskumných projektov a manažérskych schopností, s cieľom pokryť kvalitným odborným personálom plánované oblasti výskumu.

Očakávaný dosah aktivity

•    Využitie výsledkov a zapojenie mimo štátnych organizácií zaoberajúcich sa výrobou a hľadaním nových možností biotechnologických postupov kryokonzervácie, prevencie a terapie živočíchov, vytváraniu genomickej a nutrigenomickej databázy a biologickým bojom voči fytopatogénnym rastlinám.
•    Využiteľnosť aktivity je daná požiadavkami spoločnosti na vysledovateľnosť potravín, pričom jedine sekvenovanie druhej generácie je schopné uspokojiť požiadavku štátnych orgánov a firiem v oblasti forenzného testovania potravín s maximálnou mierou spoľahlivosti výsledkov.
•    V oblasti personalizovanej výživy a bezpečnosti je možné molekulové a sekvenačné metódy aplikovať v humánnej ako aj veterinárnej diagnostike metabolických dráh a efektov, ktoré ich ovplyvňujú.
•    V oblasti hodnotenia diverzity je možné metódy použiť na identifikáciu, ochranu a skúmanie ohrozených alebo kritických populácií zvierat alebo rastlín a tak aplikovať poznatky na celoštátnej alebo medzinárodnej úrovni.